Czyste czerwone komórki Aplasia i antytrytropoetyna u pacjentów leczonych rekombinowaną erytropoetyną ad

Kultury erytroidów i granulocytów ustalono jak opisano wcześniej10 przy użyciu albo normalnej połączonej surowicy od 10 zdrowych ochotników (grupa kontrolna) albo surowicy każdego pacjenta przy końcowym stężeniu 20 procent. Kolonie erytroidów i granulocytów oceniano odpowiednio w dniach 7 i 14. Wiązanie epoetyny znakowanej 125I
Wysoko oczyszczona epoetyna została wyznakowana jodem-125, jak opisano powyżej, o aktywności właściwej w zakresie od 2,5 x 107 do 5 x 107 zliczeń na minutę (cpm) na mikrogram. 11 Około 100 000 cpm znakowanej 125I epoetyny w 200 ul surowicy bydlęcej Tween albumina w soli fizjologicznej buforowanej TRIS (składająca się z 10 mM kwasu TRIS-chlorowodorowego, pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 0,02% azydku sodu, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% Tween 20) inkubowano przez noc w 4 ° C z różnymi stężenia surowicy pacjenta lub 20 .l surowicy kontrolnej. Dodano sefarozę z białkiem G (50 .l) (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) i probówki inkubowano przez kolejną godzinę z ciągłym mieszaniem. Następnie dodano 2 ml zbuforowanej TRIS solanki-Tween albuminy surowicy bydlęcej i probówki odwirowano przez 15 minut przy 1500 x g. Otrzymane peletki przemyto dwukrotnie i zliczono radioaktywność. Ta czuła metoda może wykryć przeciwciała zdolne do wiązania 200 mU erytropoetyny na mililitr surowicy.10
Badania deglycosylacji
Przeprowadzono deglikozylację epoetyny zgodnie z wcześniejszym opisem. Epoetyna znakowana 125I została rozcieńczona 200 .l 50 mM buforu fosforanu sodu (pH 5,0) zawierającym 0,1 procent eteru glikolu oktylofenylowego (NP40) i 0,02 procent azydku sodu i kolejno deglikozylowana przez inkubację przez godzinę. godzinę w 37 ° C z neuraminidazą Arthrobacter ureafaciens i przez 18 godzin z mieszaniną O-glikozydazy, endoglikozydazy F i N-glikozydazy F (wszystkie z Roche, Mannheim, Niemcy). Skuteczność deglikozylacji monitorowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, a stopień deglikozylacji nieznakowanej erytropoetyny potwierdzono za pomocą spektrometrii mas.
Denaturacja epoetyny
Deglycosylowana epoetyna znakowana 125I była denaturowana przez gotowanie w 0,1% dodecylosiarczku sodu i 50 mM ditiotreitolu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Roztwór gotowano przez pięć minut przed dodaniem 250 mM jodoacetamidu i roztwór następnie inkubowano przez jedną godzinę w 20 ° C w ciemności. Dodano NP40 w celu uzyskania końcowego stężenia 1%, a roztwór rozcieńczono 1: 1000 solą fizjologiczną buforowaną TRIS przed użyciem. W eksperymentach kontrolnych dodano epoetynę po rozcieńczeniu pożywki inkubacyjnej zawierającej dodecylosiarczan sodu, ditiotreitol, NP40 i jodoacetamid; eksperymenty te wykazały, że końcowe stężenia tych związków nie wpływają na wiązanie przeciwciała z epoetyną.
Wyniki
Pacjenci
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka 13 pacjentów. 13 pacjentów, których badaliśmy, zostało zidentyfikowanych podczas standardowego leczenia niedokrwistości z powodu przewlekłej niewydolności nerek w okresie od maja 1998 r. Do listopada 2000 r. Kliniczne cechy 13 pacjentów były podobne (tab. 1). Dwunastu pacjentów było leczonych we Francji, a jeden był leczony w Wielkiej Brytanii
[podobne: wiązki przewodzące, martwica korkowa, porady krawieckie ]
[więcej w: triamcynolon, pogotowie stomatologiczne elbląg, charakteropatia ]